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胰蛋白酶試劑盒操作原理

  • 發布日期:2012-11-22      瀏覽次數:1651
    •                                      胰蛋白酶試劑盒操作原理

       試劑盒性能:

        1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。

        2.批內與批見應分別小于9%和11%

        檢測范圍:

        0.2IU/L - 6IU/L
      使用目的:本試劑盒用于測定植物組織,細胞及其它相關樣本中膜蛋白含量。

      胰蛋白酶試劑盒實驗原理
      本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人胰蛋白酶(trypsin)水平。用純化的人胰蛋白酶(trypsin)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入胰蛋白酶(trypsin),再與HRP標記的胰蛋白酶(trypsin)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胰蛋白酶(trypsin)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中人胰蛋白酶(trypsin)濃度。
      標本的采集及保存
        1. 血清:全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。
        2. 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。
        3. 細胞培養物上清或其它生物標本:1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。
      胰蛋白酶試劑盒注意事項

       1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。

        2. 濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。

        3. 各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。

        4. 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數(×n×5)。

        5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

        6. 底物請避光保存。

        7. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

        8. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

        9. 本試劑不同批號組分不得混用。

        10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。

      胰蛋白酶試劑盒操作步驟:
             實驗開始前,請提前配置好所有試劑,試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
          1. 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應120分鐘。
      為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
         2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl(取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內配制),37℃,60分鐘。
        3. 溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,200μl/每孔,甩干。
        4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(同生物素標記抗體工作液) 100μl,37℃,60分鐘。
        5. 溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,200μl/每孔,甩干。
        6. 依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光顯色(30分鐘內,此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔顯色不明顯,即可終止)。
        7. 依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。
        8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

      有效期:6個月
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