大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表達
隨著現代生物技術的發展, 基因治療已成為繼腫瘤的手術治療和放療、化療后的又一新途徑。特別是自殺基因治療為目前國內外研究的熱點之一。大腸桿菌DeoD基因編碼的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）能將無毒的前體藥脫氧腺苷類似物分解產生劇毒的腺嘌呤類似物, 通過抑制DNA、RNA和蛋白質的合成,而引起細胞死亡。同時它能夠通過產生*的旁觀者效應,不僅使轉基因細胞被殺死,而且大量未轉基因的細胞亦被殺死[1,2]。本文對大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶（EPNP）基因進行分子克隆并構建到pcDNA3.1真核表達載體中, 并獲得穩定表達EPNP基因的MKN45細胞克隆,為今后進一步研究自殺基因在胃癌基因治療中的應用創造條件。
1 材料和方法
1.1 載體與菌株 大腸桿菌JM109和真核表達載體pcDNA3.1均購自Invitrogen公司。克隆載體pMD18T購自大連寶生物公司。
1.2 主要試劑 限制性內切酶Bam HI 和Hind III、T4DNA鏈接酶和TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker均購自大連寶生物公司；凝膠DNA提取Kit和PCR產物純化Kit購自Promega公司；LipofectaminTM Reagent、Geneticin（G418 Sulfate） 及MePdR為Invitrogen公司產品；IPTG和Xgal購自上海生物工程公司。實驗所用試劑均為進口或國產分析純試劑。
1.3 目的基因的克隆 ①引物設計: 根據GenBank數據庫提供的EPNP基因的核苷酸序列設計一對引物。為方便克隆,在上游引物和下游引物的5′端分別引入Hind III 和Bam HI 酶切位點。上游引物：5’ –ATCATAAGCTTATGGCTACCCCACACATTAATG3’下游引物：TATGGATCCTTACTCTTTATCGCCCAG3’②模板提取: 大腸桿菌JM109基因組DNA的提取,按文獻[3]方法進行。③PCR: 94℃變性5min進入循環,94℃,60秒,56℃,60秒,72℃,120秒,經30個循環擴增后72℃延伸10min。取10μl PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定。PCR產物的回收按PCR產物純化Kit上的說明進行。回收產物保存于20℃備用。
1.4 PCR產物的克隆及測序 TA克隆載體pMD18T與膠回收純化的PCR產物按1∶3（摩爾比）的比例在T4DNA連接酶作用下進行連接, 16℃反應16ｈ。取10μｌ連接反應液轉化JM109感受態細菌,將轉化的菌液涂在Xgal 處理過的含有氨芐青霉素的LB平板上培養12ｈ,在長出藍、白克隆的LB平板上挑取白色克隆進行少量擴增、質粒小提, 用酶切初步鑒定陽性細菌克隆, 將酶切鑒定正確的細菌克隆送交大連寶生物公司測序。
1.5 真核表達載體pcDNA3.1EPNP的構建和鑒定 測序正確的質粒pMD18T用限制酶Hind III和Bam HI進行雙酶切反應, 純化回收約716ｂp大小的目的片段; 質粒pcDNA3.1也進行Hind III和Bam HI雙酶切,純化回收大片段。用T4DNA連接酶連接目的片段和線性化的空質粒pcDNA3.1, 16℃反應16ｈ。轉化感受態細菌JM109,將轉化的菌液涂在含有氨芐青霉素的LB平板上培養12ｈ,挑取6個陽性克隆進行少量擴增、質粒小抽,以Hind III和BamHI雙酶切鑒定陽性細菌克隆。
1.6 真核表達載體pcDNA3.1EPNP的轉染 將重組質粒pcDNA3.1EPNP轉化的感受態細菌JM109及以空載體pcDNA3.1轉化的菌株,在LB培養基中于37℃培養18ｈ,按照質粒提取說明分別提取pcDNA3.1EPNP和pcDNA3.1,經紫外分光光度儀測定A260nm定量。按照LipofectaminTM Reagent脂質體轉染說明轉染胃癌細胞MKN45。
1.7 RTPCR 鑒定EPNP基因在MKN45細胞中的穩定表達 待具有Ｇ418抗性的MKN45細胞克隆長滿6孔板時,抽提轉染pcDNA3.1EPNP細胞（MKN45/pcDNA3.1EPNP）和轉染空載體pcDNA3.1細胞（MKN45/pcDNA3.1）總RNA, 進行RTPCR反應, 鑒定EPNP和內參照GAPDH mRNA的表達。
1.8 MTT法檢測MePdR對轉染ECPNP細胞的細胞毒作用 轉染pcDNA3.1EPNP細胞、轉染空載體pcDNA3.1細胞和親本細胞以1×104/孔接種于96孔板，24h后加入不同濃度的MePdR使終濃度分別為107、2.5×107、5×107、106、105mol/L，以不加藥的未轉染細胞作對照。每實驗組設3個復孔，培養72h后加入MTT 20μl（5μg/ml）,4h后棄上清加入DMSO溶解，震蕩10min后，酶標儀測490nm處吸光度（A）值，進而按下式計算各組細胞存活率：存活率=實驗組A值/對照組A值×100%
2 結果
2.1 目的基因克隆及測序
以大腸桿菌基因組DNA為模板經PCR擴增出一條約716bp的特異條帶,將純化的PCR產物克隆于載體pMD18T中，轉化JM109感受態細菌。藍白篩選,隨機挑取6個白色菌落提取質粒,用Hind III和BamHI雙酶切后,釋放出716bp左右的片段,見圖1。測序結果經與Genbank中登錄的序列相比較,序列*正確 （本文資料未列出），說明已成功擴增了大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的DNA序列。
PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳（略）
M：DNA Marker （DL2000）; 1:pMD18T載體和EPNP基因; 2: PCR 產物
2.2 重組表達載體pcDNA3.1EPNP的構建和酶切鑒定
重組質粒用限制酶Hind III和BamHI雙酶切,電泳結果顯示約716bp處有一特異條帶,證明目的基因已正確插入質粒pcDNA3.1,得到了真核表達載體pcDNA3.1ECPNP，。
重組質粒HindIII 和BamHI 雙酶切鑒（略）
M：DNA Marker （DL2000）; 1:pcDNA3.1; 2: EPNP基因; 3: 重組質粒pcDNA3.1EPNP雙酶切
2.3 RTPCR鑒定EPNP基因在MKN45細胞中的穩定表達
重組質粒pcDNA3.1EPNP轉染后經Ｇ418（500μg/ml）篩選得到Ｇ418抗性細胞克隆,抽提細胞總RNA行逆轉錄反應, 采用特異性擴增EPNP基因的上、下游引物進行PCR反應,得到了EPNP基因的目的條帶（716bp）,提示Ｇ418抗性細胞克隆中存在ECPNP基因。空質粒pcDNA3.1轉染后獲得的Ｇ418抗性細胞克隆經RTPCR后無特異性條帶生成，。
圖3 RTPCR 鑒定pcDNA3.1ECPNP轉染細胞情況（略）
1: MKN45/pcDNA3.1; 2、3: MKN45/pcDNA3.1EPNP ; M: DNA Marker （DL2000）
2.4 MePdR對轉染EPNP細胞的殺傷作用
用不同濃度的MePdR處理轉染細胞和未轉染細胞，MTT法檢測細胞存活率。處理72h后，許多轉染pcDNA3.1/EPNP細胞脫離了培養皿并且出現“收縮”現象，同時轉染空載體pcDNA3.1細胞和未轉染細胞仍然吸附在培養皿上未出現任何明顯的細胞毒跡象，各種細胞存活率，見表4。很明顯，MePdR并沒有影響親本細胞和轉染空載體細胞的存活率，相反，MePdR對轉染pcDNA3.1EPNP細胞有明顯的細胞毒作用。
表4 不同終濃度的MePdR（0～105mol/L）（略）
3 結論
目前常用的自殺基因體系如:HSVTK體系和CD體系只能抑制DNA的復制,只能殺傷處于分裂期的腫瘤細胞,而在實體腫瘤中只有一部分腫瘤細胞處于分裂期,故對此類腫瘤,其殺傷力受到一定限制[4，5]。而經大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶（EPNP）催化分解藥物前體6甲基嘌呤脫氧核糖核苷（MePdR）產生的MeP不但可以抑制DNA的合成,而且可以抑制RNA和蛋白質的合成,從多個環節殺傷腫瘤細胞,不但可以殺傷處于分裂期的瘤細胞,而且可以殺傷靜止的瘤細胞,具有強大的殺傷力。另外，MeP可以穿過脂質膜, 不需依賴細胞連接即可到達鄰近細胞,將其殺傷,旁觀者效應明顯[6,7]。一個自殺基因體系的旁觀者效應越強,其療效就越好。HSVTK體系的毒性產物為磷酸化物。不能透過脂質膜,只能通過細胞連接進入緊鄰細胞,故其旁觀者效應必須依賴細胞連接[8]。
據elisa試劑盒報道：
本實驗中構建的重組質粒限制性內切酶酶切圖譜與預期結果相符,獲得了約716bp大小的目的條帶。目的基因測序結果與Genbank中登錄的序列一致。因此,本實驗中克隆的EPNP DNA序列是*正確的。我們在實驗中采用特異性擴增EPNP基因的上、下游引物，通過RTPCT反應鑒定EPNP基因在轉基因MKN45細胞中的表達,證實了具有Ｇ418抗性的轉染重組質粒pcDNA3.1EPNP的MKN45細胞克隆中有EPNP基因的mRNA水平的表達;同時, 用MTT法檢測前體藥MePdR對EPNP高表達細胞的殺傷作用，發現前體藥MePdR對轉染EPNP的MKN45細胞有較強的細胞毒作用。說明EPNP確實是藥物敏感基因即自殺基因，也證明了這些細胞中有EPNP基因活性蛋白的表達。本實驗中我們成功獲得了穩定轉染EPNP基因的MKN45細胞克隆, 為進一步研究PNP的生物學功能以及在胃癌基因治療中的應用奠定了良好的基礎。
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