所有IHC/ICC研究都依賴特異的抗體-抗原表位結(jié)合，這是由疏水相互作用、氫鍵及其它分子間作用力來控制的。不過，相同的吸引力也可能引起非特異染色，即一抗與目的抗原表位之外的氨基酸結(jié)合。這是IHC/ICC實驗中經(jīng)常存在的一個問題。我們的挑戰(zhàn)在于如何降低非特異相互作用，而不損害抗體-表位的結(jié)合。上海恒遠(yuǎn)生物為您精彩分享。
非特異染色的原因包括一抗和二抗與血清蛋白的相互作用，抗體與組織之間的離子相互作用，以及與能夠影響IHC檢測系統(tǒng)的內(nèi)源分子的相互作用。這些問題會產(chǎn)生高背景，以及無法在適當(dāng)?shù)募?xì)胞位置觀察目的抗原。這種類型的染色問題可通過用封閉劑來封閉非特異相互作用來解決。在將樣本與一抗共同孵育之前，可開展這些步驟。
預(yù)防非特異疏水相互作用
盡管疏水相互作用在抗原表位-抗體的結(jié)合中起了重要作用，但這些力同樣能促進(jìn)非特異結(jié)合。由于一些氨基酸的中性側(cè)鏈，大部分蛋白有著某種程度的疏水性。將組織與熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白（BSA）共同孵育，是降低非特異疏水結(jié)合的常用步驟。正常血清類型的選擇對預(yù)防與一抗或二抗的相互作用，或預(yù)防與待染色組織/細(xì)胞的相互作用很重要。例如，在使用山羊來源的一抗時，不建議用山羊血清作為封閉劑。而是推薦與二抗的宿主動物相同的血清或來自不相關(guān)物種的血清。BSA和脫脂奶粉常用作封閉劑。這些試劑通常包含在一抗和二抗的稀釋液中。非離子去污劑如0.3% Triton X-100™或Tween 20™的添加也能降低非特異疏水相互作用。
預(yù)防非特異離子相互作用
如果使用的抗體與目的組織有著相反的凈電荷，那么離子相互作用可能導(dǎo)致非特異的背景染色。例如，非特異染色可能來自相反的羧基和氨基相互作用。范德華力、兩級分子間的弱靜電相互作用也能起作用。增加固定劑和/或抗體稀釋液的離子強(qiáng)度能降低離子相互作用。不過，表位-抗體結(jié)合通常依賴于離子強(qiáng)度，因此這種方法也可能負(fù)面影響染色特異性。由于單克隆抗體的單表位特異性，與多克隆抗體相比，增加離子強(qiáng)度更可能損害其性能。
內(nèi)源酶的干擾
顯色檢測法常使用一種結(jié)合的酶來觀察表位-抗體的相互作用。在使用這種檢測方法時，同一種酶的內(nèi)源活性必須被封閉。例如，包含辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的操作步驟可能需要試劑來防止非特異信號。腎、肝或帶有紅細(xì)胞的血管區(qū)域等組織含有內(nèi)源的過氧化物酶活性。由3-10% H2O2配制而成的過氧化物酶封閉液能用于防止內(nèi)源的過氧化物酶切割底物。內(nèi)源的堿性磷酸酶主要在腸、腎、淋巴及其它組織中發(fā)現(xiàn)，能被1 mM 左旋咪唑（Levamisole）封閉。堿性磷酸酶的腸道形式不受左旋咪唑影響，但能用1% 乙酸封閉。
內(nèi)源的生物素干擾
鏈親和素與生物素化的一抗或二抗結(jié)合，是IHC/ICC實驗常用的另一種檢測系統(tǒng)。因此，在鏈親和素孵育之前，內(nèi)源的生物素必須被封閉。內(nèi)源的生物素在多個組織中發(fā)現(xiàn)，包括肝、腎、心臟、腦和肺。樣本與親和素（avidin）預(yù)先孵育，通常可封閉內(nèi)源的生物素。接下來必須與生物素共同孵育，以封閉親和素分子上多余的生物素結(jié)合位點。在這些生物素/親和素封閉步驟之后，樣本才能與一抗孵育。
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