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RACE技術的原理

  • 發布日期:2011-11-11      瀏覽次數:4522
    •   RACE技術日益完善,目前己有商業化RACE技術產品推出,如CLONTECH的MarathoTM技術和SMARTTM RACE技術。邢桂春等(2001)先后使用上述兩種試劑盒進行RACE反應,結果發現使用MarathonTM所得到的片斷總是比采用SMARTTM RACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在于MarathonTM技術反轉錄反應往往不能真正達到mRNA的5' 末端。所以認為,進行RACE反應應當優選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國內目前應用zui廣的SMARTTM RACE試劑盒為例,簡要概述RACE技術的原理和操作過程。

      SMARTTM 3'-RACE的原理

        利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點,以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉錄合成標準*鏈cDNA.然后用一個基因特異引物GSP1(gene specific primer,GSP)作為上游引物,用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為下游引物,以cDNA*鏈為模板,進行PCR循環,把目的基因3' 末端的DNA片段擴增出來。

      SMARTTM 5'-RACE的原理

        先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點,以Oligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下,反轉錄合成標準*鏈cDNA.利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性,在反轉錄達到*鏈的5'末端時自動加上3-5個(dC)殘基,退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物配對后,轉換為以SMART序列為模板繼續延伸而連上通用接頭(見Figure 2 )。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為上游引物,用一個基因特異引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作為下游引物,以SMART*鏈cDNA為模板,進行PCR循環,把目的基因5'末端的cDNA片段擴增出來。zui終,從2個有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產物中獲得全長cDNA,或者通過分析RACE產物的3'和5'端序列,合成相應引物擴增出全長cDNA。

      實驗中發現,做RACE反應實驗實際操作中仍存在不少困難。因此,對RACE反應條件進行反復摸索是十分必要的。這是因為:

      *,在5'-RACE包含了有3個連續的酶反應步驟(反轉錄、同聚物加尾和PCR擴增),每一步都可能導致失敗;

      第二,擴增DNA末端的特異性*依賴錨定引物及擴增DNA模板樣品的不均一性,因而特異性一般很低,常呈現不清晰的成片條帶或截短的產物背景。因此,使用RACE技術擴增得到的特異末端片段,所獲得的重組克隆能夠全部測序,以排除RACE實驗結果中擴增產物假陽性和假陰性,zui終有可能獲得新基因的全序列。

      隨著RACE的不斷改進和完善,優化條件下PCR擴增效率和忠實性的提高及PCR產物克隆技術的迅速發展,RACE必將在基因克隆及基因表達研究中發揮越來越大的作用。

      RACE的另一種代表方法-Self-Ligation法

      1. 反轉錄(RT)反應。

      2. Hybrid RNA的分解。

      3. 單鏈cDNA的自身連接。

      4. PCR擴增5'未知區域。

      5. 目的DNA片段的切膠回收。

      6. DNA序列測定。

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